双靶向ANXA2/CD147 CAR-T细胞疗法用于骨肉瘤动物模型研究数据

2026年8月3日，在期刊《Oncogene》上，发表了一篇《双靶向ANXA2/CD147 CAR-T细胞疗法用于骨肉瘤》的相关研究内容^[1]。

1、摘要

骨肉瘤是一种高度恶性的肿瘤，预后不良。目前针对骨肉瘤的CAR-T细胞疗法主要为单靶点设计，但其疗效仍不令人满意。

本研究开发了一种新型双特异性CAR-T细胞，旨在为改善骨肉瘤的治疗效果提供实验基础。通过单细胞RNA测序（scRNA-seq），鉴定出骨肉瘤细胞中两个高表达的抗原——ANXA2和CD147，并通过qRT-PCR、流式细胞术和免疫组织化学在组织水平进一步验证了它们的表达。

基于第二代CAR骨架，利用磁珠分选、原代T细胞培养和慢病毒转导，构建了双特异性ANXA2/CD147 CAR-T结构，转导效率达47.1%。

乳酸脱氢酶（LDH）释放实验表明，双特异性CAR-T细胞对肿瘤细胞的细胞毒性显著强于单靶点组和对照组。

酶联免疫吸附测定（ELISA）证实，双特异性CAR-T细胞释放了更高水平的效应分子，包括颗粒酶B（GZMB）和肿瘤坏死因子α（TNFα）。

在皮下CDX模型中，双特异性CAR-T细胞表现出更优的抗肿瘤活性和更强的T细胞浸润。

在爪垫异种移植模型中，接受双特异性CAR-T细胞治疗的小鼠肿瘤体积最小、肿瘤重量最低，且淋巴结转移率降低。

此外，患者来源异种移植（PDX）模型证实，双特异性CAR-T细胞可有效抑制骨肉瘤生长。

对CDX模型来源肿瘤的scRNA-seq分析和免疫组织化学显示，双特异性组中M1型巨噬细胞浸润显著增加。

综上，本研究成功构建了具有强效抗肿瘤活性的双特异性ANXA2/CD147 CAR-T细胞，为骨肉瘤的免疫治疗提供了一种有前景的新策略。

2、引言

骨肉瘤（OS）是最常见的恶性骨肿瘤，主要发生于青少年的长骨。其特点是高度侵袭性和早期远处转移倾向，对青少年患者的身心健康构成严重威胁。

当前的标准治疗方案——包括新辅助化疗、手术切除和辅助化疗——已显著改善了患者的5年生存率。然而，预后仍不理想：局限性疾病的5年生存率约为60%，但发生转移的患者则降至30%以下。

尽管近年来有几种新型抗癌药物获批，但总生存期并未得到显著改善。因此，开发创新的治疗策略对于改善患者预后至关重要。

过继细胞治疗（ACT）是指收集自体免疫细胞，经过基因工程改造和体外扩增后，将修饰后的细胞回输至患者体内以介导抗肿瘤活性。

在ACT方法中，嵌合抗原受体T细胞（CAR-T）疗法是其中最为先进且应用最广泛的模式。多种CAR-T产品已实现临床转化，并在血液系统恶性肿瘤中展现出显著疗效。

尽管多项临床前研究已证明CAR-T细胞在骨肉瘤中的治疗潜力，但临床研究结果却不尽如人意。

2015年，一项纳入19例HER2阳性肉瘤患者（包括16例骨肉瘤）的I/II期临床试验（NCT00902044）结果显示，递增剂量的HER2-CAR-T细胞（1×10⁴至1×10⁸/m²）耐受性良好。在14例可评估的骨肉瘤患者中，无一例达到缓解，4例达到疾病稳定，其余患者出现疾病进展。

最近，2024年的一项I期前瞻性研究纳入了14例难治性肉瘤患者，接受1×10⁸/m²的HER2-CAR-T输注。包含的8例骨肉瘤患者中，仅1例达到完全缓解，2例达到疾病稳定，其余患者出现进展。

这些发现凸显了开发和优化CAR-T疗法以改善骨肉瘤患者生存率的迫切需求。

骨肉瘤是一种具有高度瘤内异质性的实体肿瘤，其特征是在同一病灶内共存多个肿瘤细胞亚群，每个亚群表达不同的肿瘤抗原。

这种异质性显著降低了CAR-T细胞的识别和细胞毒活性。为应对这一挑战，研究人员设计了双特异性CAR-T细胞，即在单个CAR结构中连接两个不同的单链可变区片段（scFv）。

这种设计使得CAR-T细胞能够通过识别任一抗原而被激活，从而增强其启动抗肿瘤反应的能力。与传统的单靶点CAR-T细胞相比，双特异性CAR-T细胞已在多种实体瘤中展现出更优的疗效。然而，其在骨肉瘤中的应用报道仍然很少。

在本研究中，研究人员鉴定并验证了ANXA2和CD147在骨肉瘤中的高表达，并通过慢病毒转导原代T细胞构建了一种新型双特异性ANXA2/CD147 CAR-T细胞。其抗肿瘤功效在体外和多个体内模型中得到了证实。此外，单细胞RNA测序（scRNA-seq）揭示，双特异性CAR-T细胞治疗促进了肿瘤微环境中M1型巨噬细胞的浸润增强。据了解，这是关于双特异性ANXA2/CD147 CAR-T细胞应用于骨肉瘤治疗的首次报道。

3、材料与方法

人骨肉瘤组织的单细胞RNA测序及数据处理

为鉴定骨肉瘤细胞中特异性过表达的肿瘤抗原，对来自14例骨肉瘤患者的临床样本进行了单细胞RNA测序（scRNA-seq），包括原发肿瘤（PT，n=14）、癌旁正常组织（ANT，n=6）、转移淋巴结（MLN，n=2）和阴性淋巴结（NLN，n=4）。此外，还收集了来自GEO数据库的公开骨肉瘤数据集（GSE152048，n=7）和股骨头样本（GSE169396，n=4），用于靶标表达的验证。

小鼠肿瘤组织的单细胞RNA测序及数据处理

为研究CAR-T治疗对肿瘤微环境的影响，收集了12只小鼠的肿瘤进行scRNA-seq。在DNBSEQ-T7平台上对单细胞悬液进行测序。使用Cell Ranger（v7.1.0）进行定量。保留检测到500–4500个基因且线粒体含量<25%的细胞。根据cell_classification.csv文件鉴定细胞来源（人骨肉瘤细胞系来源 vs. 小鼠来源）。

CAR-T细胞的生成

使用Ficoll-Paque（Cytiva，美国）从健康供者外周血中分离外周血淋巴细胞。采用阳性分选试剂盒富集CD3⁺ T细胞，并使用CD3/CD28激活剂进行刺激。当T细胞进入增殖簇时，在聚凝胺存在下，通过离心用慢病毒颗粒转导T细胞。T细胞在ImmunoCult™-XF培养基中培养和扩增。通过流式细胞术评估转导效率和T细胞表型。

治疗给药

CAR-T细胞在肿瘤建立后第0天和第5天各静脉注射两次（每只小鼠1×10⁶个细胞，每次注射50 μL）。顺铂根据人与小鼠等效剂量换算，以2 mg/kg腹腔注射，每7天一次，共两次。

4、结果

ANXA2和CD147在骨肉瘤及转移淋巴结中高表达

为鉴定骨肉瘤中高表达的肿瘤相关抗原，对26例临床样本进行了单细胞RNA测序（scRNA-seq），包括原发肿瘤（PT，n=14）、癌旁正常组织（ANT，n=6）、转移淋巴结（MLN，n=2）和阴性淋巴结（NLN，n=4）。

根据经典标志物基因表达对每个细胞簇进行注释。簇4显示出IBSP、ALPL和RUNX2的高表达，这些基因与成骨细胞分化相关，因此被注释为成骨细胞（OB）。

既往研究表明，与来自癌旁组织的成骨细胞相比，骨肉瘤中的成骨细胞表现出更大的拷贝数变异、更高的恶性程度以及丰富的促肿瘤基因表达；因此，这些成骨细胞被归类为骨肉瘤细胞。

骨肉瘤细胞与成骨细胞之间的差异表达分析显示，ANXA2和CD147在骨肉瘤组织和转移淋巴结中显著上调。在已发表的骨肉瘤scRNA-seq数据集中观察到一致的结果，即与成骨细胞相比，骨肉瘤细胞中ANXA2和CD147的表达仍然显著更高。

为验证这些发现，流式细胞术显示，与癌旁正常组织相比，骨肉瘤组织中ANXA2和CD147的表达显著更高。qRT-PCR进一步证实了骨肉瘤中ANXA2和CD147转录本水平的升高，免疫组织化学验证了这两种标志物的强烈蛋白表达。ANXA2和CD147均编码膜相关蛋白，适合作为肿瘤抗原。基于这些结果，选择ANXA2和CD147作为CAR-T细胞构建的靶抗原。

ANXA2-CD147-CAR-T细胞的构建与特性

构建了第二代ANXA2-CD147 CAR构建体（以下简称双特异性CAR），其中ANXA2特异性单链可变区片段和CD147特异性单链可变区片段通过刚性EAAK连接子串联连接。

从健康供者中分离外周血单个核细胞（PBMC），并通过磁珠分选富集CD3⁺ T细胞。流式细胞术证实CD3⁺ T细胞纯度为93.4%。随后通过流式细胞术评估转导效率，结果显示MOCK-CAR-T细胞为57.3%，ANXA2-CAR-T细胞为45.9%，CD147-CAR-T细胞为43.3%，双特异性CAR-T细胞为47.1%。双特异性CAR转导的T细胞。

生长动力学分析显示，所有CAR-T组均有效扩增，在转导后第9天达到约30倍的扩增量，表明双特异性CAR的引入并未损害T细胞的增殖能力。流式细胞术显示，与非转导T细胞（NT）相比，各CAR-T组之间CD4⁺和CD8⁺ T细胞的比例无显著差异。

ANXA2-CD147-CAR-T细胞在皮下CDX模型中抑制骨肉瘤生长

在裸鼠中建立了皮下细胞来源异种移植（CDX）模型以评估体内疗效。顺铂治疗作为阳性对照。与ANXA2-CAR-T组和MOCK组相比，双特异性CAR-T组的肿瘤体积和重量显著减小。

尽管双特异性CAR-T组与CD147-CAR-T组之间的差异未达到统计学显著性，但观察到有利于双特异性构建体的趋势。重要的是，在肺或肝脏中未检测到明显的毒性。

综上所述，这些结果表明双特异性CAR-T细胞在体内发挥强效的抗肿瘤作用。

双特异性CAR-T细胞抑制骨肉瘤生长和淋巴结转移

为进一步评估抗转移活性，使用143B细胞建立了爪垫异种移植-腹股沟淋巴结转移模型。

CAR-T治疗后，与单特异性CAR-T组和MOCK组相比，双特异性CAR-T组的肿瘤体积和重量显著更低。

此外，双特异性CAR-T治疗组小鼠的腹股沟淋巴结明显小于其他组。H&E染色证实，双特异性CAR-T治疗组5只小鼠中仅有1只出现淋巴结转移，而ANXA2-CAR-T组为3只，CD147-CAR-T组和MOCK组各为4只。

共聚焦显微镜显示，双特异性CAR-T治疗组小鼠肿瘤中GFP荧光更强，表明T细胞浸润和扩增增强。这些发现表明，双特异性CAR-T细胞不仅能抑制原发肿瘤生长，还能抑制淋巴结转移。

双特异性CAR-T细胞在PDX模型中显示出强效抗肿瘤活性

通过将手术切除的骨肉瘤标本皮下植入裸鼠，建立了患者来源异种移植（PDX）模型。PDX模型具有临床相关的预测价值，被认为是转化肿瘤学研究的重要工具。

在这些模型中，与单特异性CAR-T组和MOCK组相比，双特异性CAR-T治疗显著减小了肿瘤体积。共聚焦成像证实，双特异性CAR-T组中GFP⁺CD3⁺ T细胞浸润水平最高。此外，收集了各组小鼠的肝脏组织并进行H&E染色，未观察到明显的肝损伤。这些结果进一步验证了ANXA2-CD147双特异性CAR-T细胞强大的体内抗肿瘤疗效。

治疗组间比较显示，与单特异性CAR-T组和MOCK组相比，双特异性CAR-T组中M1_Mac的比例显著增加。使用MiloR进行的差异丰度分析进一步证实，与MOCK相比，单特异性CAR-T增加了M1_Mac的浸润，而双特异性CAR-T治疗导致了更显著的富集。综上所述，这些发现表明双特异性CAR-T治疗增强了M1巨噬细胞浸润，从而促进抗肿瘤免疫。

5、讨论

近年来，CAR-T疗法作为一种新型免疫治疗策略，在血液系统恶性肿瘤中取得了显著成功。相比之下，虽然在部分实体瘤中已显示出初步的治疗潜力，但其更广泛的应用仍然受限。对于骨肉瘤而言，高度复杂的肿瘤微环境和显著的抗原异质性仍然是临床转化的重大障碍。因此，亟需开发更有效、更安全的CAR-T疗法。

在本研究中，利用scRNA-seq鉴定了骨肉瘤细胞中高表达的两个肿瘤相关抗原。基于这些发现，构建了一种新型双特异性CAR-T构建体——ANXA2/CD147 CAR-T，并对其进行了评估。在体外和多个体内模型中，这些工程化T细胞均表现出强大的抗肿瘤活性和转移抑制作用。

由于CAR-T细胞依赖肿瘤抗原进行识别，选择合适的靶点对于治疗效果至关重要。理想的CAR-T靶点应满足以下几个标准：

1、广泛覆盖，在大多数肿瘤细胞中高表达以确保有效的细胞毒性。

2、强特异性，在肿瘤组织中高表达，但在正常组织中不表达或极低表达。

3、稳定且持续的表达，以最大限度地减少抗原逃逸。膜联蛋白A2（ANXA2）是膜联蛋白家族中一个36 kDa的成员，满足了上述许多要求。ANXA2在食管癌、乳腺癌和胃癌等癌症中经常过表达，其上调与不良预后相关。功能上，ANXA2促进肿瘤增殖、迁移和侵袭[28, 29]。既往研究报告，ANXA2-CAR-T细胞在体内外均发挥强效的抗卵巢癌作用[20]。在本研究中，我们发现ANXA2在骨肉瘤细胞中高表达，因此将其选为CAR靶点之一。

骨肉瘤转移主要通过血行播散，肺是最常见的转移部位，但多项研究表明，部分患者也可发生区域淋巴结转移，且与极差的预后相关。

中国研究者利用SEER数据库和独立收集的多中心队列证明，伴有淋巴结转移的骨肉瘤患者生存率显著更差，5年生存率低于20%。

此外，Thampi等人分析了SEER数据库中2748例高级别骨肉瘤患者，发现诊断时区域淋巴结受累罕见，仅占2.7%的患者；然而，这些患者的5年总生存率仅为10.9%，而无淋巴结受累的患者为54.3%，区域淋巴结受累仍是一个独立的负面预后因素。

因此，研究骨肉瘤淋巴结转移的治疗策略具有重要的临床意义。本研究中开发的双特异性CAR-T细胞被证明能够抑制骨肉瘤的淋巴结转移，这可能是因为ANXA2和CD147在转移淋巴结中均高表达。

本研究成功开发了一种新型ANXA2/CD147双特异性CAR-T细胞疗法，在体内外均显示出强效的抗肿瘤活性。这些发现为推进骨肉瘤免疫治疗提供了一种有前景的策略。